PTC Therapeutics利用简化AAV滴度测定
今天，制造质量稳定的重组腺相关病毒（rAAV）的主要挑战之一仍然是目前的分析工具不够。
（rAAV）质量稳定的主要挑战之一仍然是目前的分析工具不足以满足所有需求。这是由于它们的高变异性（CV 20-40%）、低样本量和长周转时间。此外，工艺开发可能很耗时，特别是需要许多开发周期来实现开发批次之间稳健和一致的可比对性。可变紫外-可见分光光度计技术（VPT）提供了一种AAV滴度测定的新方法，它消除了对浓度的依赖和由样品操作引起的相关变异性。在这篇文章中，我们将展示如何利用VPT进行旁线/在线的过程控制，在开发过程中提供快速和直接的病毒载体总量分析，以提高产量并改善决策。将探讨SoloVPE和FlowVPX技术在AAV病毒滴度方面的应用。斜率光谱法是一种分析技术，当纯化过程的任何阶段需要快速、可比对的结果时，可以使用这种技术，以便对该阶段的滴度有信心并允许继续处理。斜率光谱法在生物制品生产中的应用已经超过十年。常见的应用包括质粒浓度和纯度、DNA浓度和纯度、病毒滴度、UF/DF监测，以及空/满壳测试。SoloVPE和FlowVPX的设计是为了确保方法的完整性在每个过程步骤中都得到贯彻。SoloVPE不依赖固定的光程来进行任何样品测量（图1）。光程是一个可变值，可在1分钟内完成多个吸光度的测量。浓度是一个固定值，不需要像传统的UV-Vis光谱法那样对样品进行稀释。SoloVPE和FlowVPX保证了基于0.999或更高的R2值的线性结果。为了收集数据，全自动设备会降低到设置零光程长度，通过算法找到1个Au。然后设备将收集多达10个不同光程长度的吸光度数据，以计算斜率回归。光程长度范围从5微米到15毫米，步径可小到5微米。
图1 传统的紫外光谱仪与可变路径长度光谱仪。
ViPER AAV应用软件
Viper AAV应用软件已经发展成为一个专门用于计算AAV病毒滴度的自动化解决方案。为了收集数据，需要确定DNA和蛋白质的波长。有四个消光系数需要计算病毒滴度浓度。用户将负责输入260nm DNA的消光系数。这将来自于分子量，或通过将DNA序列直接输入软件来计算消光系数。然后，测试结果将在一分钟内出现在屏幕上。还有一个序列输入，用于使用DNA序列确定消光系数。AAV下游工艺开发：PTC Therapeutics的案例分析简介
PTC Therapeutics基因治疗卓越技术中心拥有质粒DNA和AAV产品的工艺开发、测试和GMP生产的综合空间。PTC拥有一个多元化的研究平台，拥有六个商业产品的组合：五个小分子药物和一个基因治疗产品Upstaza（eladocagene exuparvovec）。Upstaza是一种基于AAV2的基因疗法，用于治疗芳香族L-氨基酸脱羧酶（AADC）缺乏症，于2022年7月得到欧洲药品管理局（EMA）的批准。除了为有需要的患者带来急需的治疗外，该产品还标志着第四个体内基因治疗产品在美国或欧洲获得批准，突出了其对整个行业的重要性。在PTC Therapeutic的管道中还有更多的基因治疗候选产品。当AAV在上游细胞培养中以工业规模生产时，要经过细胞分解和澄清步骤，然后进行捕获色谱（利用亲和色谱或离子交换（IEX）色谱）。在捕获步骤之后，载体产品将经过精制步骤，用IEX色谱法或其他方法将完整的衣壳与空的衣壳分开。在精制步骤之后，纯化的AAV在最终配制和填充完成之前要经过UF/DF步骤。工艺开发团队的目标是提供一个强大的、可扩展的纯化工艺，以有效的形式生产AAV。确保所有工艺参数符合关键质量属性（CQAs）的规格是很重要的。关键的质量属性包括AAV基因组滴度、衣壳滴度和完整/空的衣壳比率。目前，PTC的内部AAV定量方法包括定量PCR 方法包括定量PCR (qPCR)/数字液滴PCR（ddPCR），用于基因组滴度测定，以及衣壳蛋白的酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay)。酶联免疫吸附试验(ELISA) 测定衣壳蛋白的滴度。这些都是工业标准的测试方法，但它们的缺点是需要长达2周的周转时间和测试实验的积压。
SoloVPE评估
PTC Therapeutics公司与Repligen CTech公司合作，评估CTech SoloVPE作为快速和简单的AAV滴度测量的临时分析方法。该系统对每个样品的直接测量时间不到5分钟。CTech团队在现场帮助 PTC Therapeutics建立该方法并测量一些正在进行的样品，包括亲和洗脱、精制洗脱，以及一些切向流过滤过程中的一些中间产物步骤。在最初的评估中，基因组滴度和衣壳滴度是用SoloVPE测量的。使用SoloVPE，并将这些数值与通过qPCR获得的基因组滴度和通过ELISA获得的衣壳滴度进行比较。SoloVPE系统与qPCR比较，对数10的差异为7.4%，与ELISA比较则小于4%。初步评估显示SoloVPE的数据与qPCR和ELISA的数据显示出良好的可比性。为了评估SoloVPE的准确性，我们对下游工艺开发的更多在制品进行了测量。并将使用SoloVPE的基因组滴度和衣壳滴度同时测定，并将使用SoloVPE采集的数据与使用qPCR和ELISA方法收集的数据进行比较 (图2)。SoloVPE的滴度数据与qPCR的数据显示出很好的可比性，呈线性趋势，R2为0.9842。
图2 在SoloVPE上收集的基因组滴度数据与qPCR和capsid ELISA评估的准确性
衣壳滴度在SoloVPE数据和衣壳滴度在ELISA数据之间也显示出更大的线性可比性，R2值为0.9952。SoloVPE的线性度评估（图3）。一个浓缩的 AAV样品被稀释到12个不同的浓度。SoloVPE的数据显示与预期的qPCR和 稀释液中的衣壳的ELISA值有很好的相关性。qPCR测试的浓度范围：4.7×1011- 2.6×1013 vg/mL；衣壳的ELISA测试浓度范围： 2.9×1012- 1.6×1014 capsid/mL。
图3 在SoloVPE上收集的基因组滴度数据与qPCR和Capsid ELISA的数据进行比较
接下来，评估了SoloVPE的可重复性。AAV样品被一式三份，使用相同的光纤棒和相同的等分样品在样品容器中测量。斜率260和斜率280的测量结果%RSD（相对标准偏差相对标准偏差）都小于2%。SoloVPE的中间精密度也进行了分析。AAV样品由两位科学家在不同的日子里使用不同的光纤棒、比色皿和样品等分量。斜率260和斜率280值的RSD也很小，小于 1%。在确定了准确性、线性、重复性 ，以及中间精密度后，评估了SoloVPE在AAV下游工艺开发中的潜在应用。图4显示了亲和层析法的装载能力研究。SoloVPE技术被用来估计洗脱液中回收的基因组滴度，并证明三倍的装载量可使洗脱池中的基因组滴度提高三倍左右。在这种较高的装载量下，该柱子的最大装载量还没有达到。SoloVPE在亲和层析中的其他潜在应用包括停留时间研究、缓冲液添加剂研究和洗脱缓冲液pH值研究。SoloVPE也可用于精制色谱。SoloVPE载体滴度和完整衣壳百分比的测量可在AAV精制步骤的开发中根据回收率和完整衣壳富集，以决定哪种缓冲液条件是每个目的的理想选择。SoloVPE在精制步骤中的其他潜在应用包括填料筛选、缓冲液添加剂筛选、装载能力、停留时间、装载pH值/传导性、洗脱缓冲液pH值传导性以及梯度/步骤洗脱研究。SoloVPE也可以应用于UF/DF工艺。在这个步骤中，纯化的AAV在缓冲液交换和配制前被浓缩。对这一步骤进行过程控制以确保准确的浓度是很重要的。在这个过程中监测产品的滴度可以减少产品意外损失的机会。使用SoloVPE对起始材料和其他三个样品在浓缩步骤或最终产品中进行了测量基因组滴度的实验。使用SoloVPE计算了浓缩因子，它与体积缩小的计算结果很一致。这表明SoloVPE可以作为一种新型的UF/DF过程中控制方法使用。
图4 使用SoloVPE系统进行层析开发
在线客服
